Informacje o projekcie

W ramach badań środowiskowych i biologicznych zostanie wykonana:

• Ocena morfofizjologiczna gamet i wczesnych stadiów rozwojowych – celem tych badań będzie wykazanie, czy jakość wód wpływa w widoczny sposób na gamety i rozwój zarodkowy ryb. Próby pobierane będą w sezonie rozrodczym, a każda obejmować będzie reprezentatywną liczbę osobników obu płci.
• Badanie jakościowe gamet – za pomocą systemu CASA określana będzie ruchliwość plemników ze szczegółowym rozróżnieniem na plemniki poruszające się ruchem bardzo szybkim, szybkim i wolnym, ich koncentracja oraz prawidłowość budowy, jak również mierzony będzie spermatokryt.

Analizowane będą m.in. następujące parametry ruchu plemników:

• MOT czyli odsetek plemników ruchliwych (%)
• VCL – średnia prędkość ruchu krzywoliniowego
• VSL – prędkość ruchu prostoliniowego
• VAP – całkowita prędkość ruchu plemnika
• LIN – liniowość ruchu plemnika
• STR – prostoliniowość ruchu plemnika
• ALH – amplituda odchylenia główki plemnika
• BCF – częstotliwość uderzeń witki plemnika

Uzyskany obraz poruszających się plemników badany będzie poklatkowo przy pomocy programu komputerowego analizującego na bieżąco parametry ruchu.

• Analiza komet (comet assay) – w celu oszacowania ewentualnych uszkodzeń DNA plemników zostanie zastosowana komputerowa analiza uzyskiwanych obrazów oparta na pomiarze fluorescencji komet (comet assay).
• Jaja – obliczana będzie ilości jaj dojrzałych w próbie (zdolnych do zapłodnienia), co pozwo-li na ustalenie płodności względnej. Oceniania będzie wytrzymałość osłonek jajowych oraz ich struktura histologiczna (mikroskopia świetlna, konfokalna i skaningowa).
• Badania rozwoju zarodkowego ryb – w trakcie doświadczeń prowadzone będą ciągłe obserwacje (mikroskopy, kamery, monitory, komputery) rozwijających się zarodków,
  ze szczególnym uwzględnieniem tzw. okresów krytycznych, a obraz dodatkowo będzie rejestrowany w celu późniejszej analizy. Obliczane będą również straty ogólne. Badania nad przebiegiem inkubacji oraz embriogenezą wybranych gatunków ryb w warunkach maksymalnie zbliżonych (o ile nie tożsamych – chemizm wody, temperatura, oświetlenie, natlenienie) do warunków w jakich przebiega embriogeneza tych gatunków w środowisku naturalnym, pozwoli wykazać czy warunki dla realizacji wczesnej ontogenezy mieszczą się w przedziałach norm wyznaczonych przez wymogi biologiczne danego gatunku. Pozytywne wyniki niniejszych badań mogą być wykorzystane w warunkach terenowych przy otrzymywaniu co najmniej dobrej jakości gamet od tarlaków.

Analiza długości, masy i kondycji oraz wzrostu ryb

Sieje będą łowione w południowej części Zalewu Szczecińskiego przy pomocy żaków i wontonów siejowych, natomiast certy będą pochodziły z elektropołowów. Po połowie złowione ryby będą ważone (na elektronicznej wadze typu Axis z dokładnością do 0,1 g) i mierzona (długość całkowita, długość ogonowa i długość ciała (przy użyciu suwmiarki elektronicznej z dokładnością pomiaru 0,1 mm). Kondycja ryb zostanie określona przy pomocy współczynnika kondycji Fultona, Clark i Le Crena (Bolgier i Conolly 1989) oraz poprzez analizę parametrów „n” i „k” zależności pomiędzy długością całkowitą a masą ryb (L-W). Wiek ryb i tempo wzrostu długości i masy zostanie ocenione na podstawie łusek. Przy pobieraniu łusek zastosowana zostanie metodyka dla siei podana przez Bernatowicza (1952), oraz dla ryb karpiowatych, w tym certy podawana przez Hesse (1992). Następnie łuski zostaną oczyszczone z resztek śluzu w roztworze wody amoniakalnej i zostaną przygotowywane preparaty. Odczyt wieku oraz pomiary promieni łusek wykonane zostaną u siei na ich częściach oralnych, natomiast u certy na częściach kaudalnych, przy pomocy zestawu komputerowego, z zainstalowanym specjalistycznym programem do analizy obrazu “MultiScan” lub „Lucia” (dokładność pomiaru 0,001 mm). Jeżeli zależność R-L zostanie oceniona jako prostoliniowa to odczyty wsteczne wykonane zostaną w wariancie Rosy-Lee z uwzględnieniem standardu, przy którym u siei i certy zakłada się łuska. W przypadku zależności krzywoliniowej, tempo wzrostu zostanie wykonane przy pomocy odczytów wstecznych za pomocą równania Wowka. Uzyskane metodami odczytów wstecznych dane empiryczne wykorzystane zostaną do przedstawienia teoretycznego wzrostu długości ryb za pośrednictwem matematycznego modelowania wzrostu przy pomocy równania von Bertalanffy’ego (Szypuła i in.2001). Wzrost masy ryb oszacowany zostanie poprzez przeliczenie długości w kolejnych latach życia na masę zgodnie z równaniem W=kLⁿ.

Analiza pokarmu ryb

Skład pokarmu zostanie oceniony na podstawie zawartość przewodów pokarmowych pobranych od poszczególnych osobników. Pobrane przewody pokarmowe będą konserwowane w 80% roztworze etanolu. Po przywiezieniu do laboratorium Zakładu Gospodarki Rybackiej i Ochrony Wód, Zachodniopomorskiego Uniwersytetu Technologicznego, przeprowadzone będą analizy stopnia napełnienia przewodów pokarmowych oraz składu ich diety. Analizując pokarm ryb będą się posługiwać się metodą polegającą na wizualnej ocenie stopnia napełnienia żołądków i w zależności od napełnienia podzielono je na 5 klas. Klasa I odpowiadała żołądkom pustym, II klasa napełnieniu żołądka w stopniu od 1 do 24 %, III – 25-49%; IV – 50-74% i V – 75-100% (Hyslop 1980). Po wyeliminowaniu pustych układów pokarmowych, zawartość przewodu pokarmowego ryby zostanie rozcieńczona w 100, 50 lub 20 ml wody (w zależności od stopnia napełnienia przewodu pokarmowego). Otrzymana po rozcieńczeniu zawartość przewodu zostanie przeniesiona na komorę planktonową. Podstawą do określenia ilościowego i jakościowego składu pokarmu badanego gatunku będą wyniki analizy zawartości przewodów pokarmowych. Analiza pokarmu będzie polegała na oznaczeniu poszczególnych taksonów, oraz określeniu ich liczebności pod binokularem przy powiększeniu odpowiednim do wielkości osobnika stwierdzonego w pokarmie ryby. Wyniki oznaczeń zostaną przeliczone na całą objętość treści pokarmowej ryby. Skład pokarmu określano metodami: liczbowego udziału poszczególnych składników pokarmowych (UL) tj. udział liczbowy w grupie komponentów policzalnych  oraz częstości ich występowania (CZW) tj. częstość występowania danego komponentu (wyrażona w %) (Hyslop 1980, Szypuła i in. 2001).

Charakterystyka zespołów bezkręgowców jako bazy pokarmowej dla ryb

Zooplankton stanowi pośredni poziom troficzny w sieciach pokarmowych w pelagialu wód Zalewu Szczecińskiego. Z uwagi na liczne występowanie jest on podstawowym pokarmem larw i narybku wielu gatunków ryb, a i często uzupełnieniem diety ryb dojrzałych. Zmiany zachodzące z roku na rok w intensywności rozwoju i liczebności przedstawicieli poszczególnych gatunków zwierząt planktonowych znajdują swe odbicie w sposobie odżywiania się ryb, a spadek liczebności może prowadzić do pogorszenia warunków żerowania. Jego badania są pomocne przy określaniu zasobów pokarmowych dla ryb, w tym dla siei.

Skład gatunkowy zooplanktonu tego zbiornika ma najczęściej charakter słodkowodny, jednak często występują także gatunki słonowodne, a w okresie wlewów wód bałtyckich – także gatunki morskie. Zooplankton Zalewu Szczecińskiego charakteryzuje się również znaczną liczebnością przy małej liczbie gatunków, co jest charakterystyczne dla zbiorników przyujściowych. Głównym składnikiem planktonu zwierzęcego są wrotki Rotatoria, wioślarki Cladocera i widłonogi Copepoda, poza tym tworzą go m.in. pierwotniaki i larwy mięczaków. Cechą charakterystyczną zooplanktonu jest istnienie rytmiki jej liczebności w ciągu roku, która uzależniona jest od całego kompleksu warunków środowiskowych (temperatura, obfitość pokarmu, wybiórczość pokarmowa, drapieżnictwo). Drapieżnictwo jako czynnik wpływający na liczebność i jakość składy fitoplanktonu występuje bardzo wyraźnie, jeżeli drapieżnikiem jest ryba planktonożerna. Może to prowadzić np. do eliminacji dużych gatunków przy równoczesnym zwiększaniu gatunków drobnych, co może ograniczać dostępność bazy pokarmowej.

Badania parazytologiczne form młodocianych ryb

W ramach projektu przeprowadzony zostanie monitoring parazytologiczny form młododcianych ryb. Monitoring zostanie przeprowadzony pod kątem obecności pasożytów zarówno zewnętrznych, jak i wewnętrznych. Szczególny nacisk położony będzie na identyfikację wysoce patogenicznych przywr. Dla każdej z ujętych w programie rzek zostanie określony stopień ryzyka zarażenia ryb wspomnianymi pasożytami.

Bardzo ważnym elementem badań prowadzonych w ramach projektu będzie także kontrola objętych monitoringiem ryb pod kątem pasożytów potencjalnie zagrażających zdrowiu człowieka, w szczególności larw tasiemców z rodzaju Dipothriocephalus. Dibothriocephalus latus (bruzdogłowiec szeroki) należy do najczęściej notowanych tasiemców człowieka, a zarażenie nim następuje w wyniku spożycia surowego bądź nieprawidłowo przyrządzonego mięsa ryb.

Wynik przeprowadzonego monitoringu pasożytniczego będzie ważną składową w określaniu kondycji ryb. Umożliwi on także stwierdzenie, czy w przyszłości dana rzeka będzie odpowiednia do kontynuacji programów zarybieniowych. Podjęta zostanie próba stworzenia sieci neuronowej, która umożliwi zaawansowaną interpretację uzyskanych danych i pozwoli na obranie kierunku w przyszłych próbach restytucyjnych. Zastosowanie tej innowacyjnej metody pozwala na wyznaczenie modelu, który w przyszłości pozwoli na oszacowanie ryzyka prowadzonych działań.

Przebieg badań:

Po dostarczeniu ryb do laboratorium zostaną określone współczynniki kondycji ryb, t.j. współczynnk kondycji Fultona, współczynnik kondycji Clarca oraz współczynnik hepatosomatyczny.

W pierwszym etapie sekcyjnym przeprowadzone zostaną badania pod kątem pasożytów zewnętrznych. Pobrane zostaną zeskrobiny z powłok ciała, płetw oraz wieczek skrzelowych, w celu wykonania nietrwałych preparatów mikroskopowych. W dalszej kolejności wykonane będą nietrwałe preparaty mikroskopowe z każdego z wypreparowanych łuków skrzelowych. Z jamy nosowej i gębowej zostaną pobrane wymazy, które będą poddane badaniu mikroskopowemu. Ostatnią częścią tego etapu pracy badawczej będzie wypreparowanie ciałek szklistych i soczewek oczu, z których wykonane zostaną preparaty gniecione.

Drugim etapem prowadzonych badań sekcyjnych będzie poszukiwanie i izolacja pasożytów wewnętrznych. Po przecięciu powłok brzusznych ryby wypreparowane zostaną następujące narządy: serce, żołądek, wyrostki pyloryczne, jelito, wątroba, trzustka, śledziona, pęcherz pławny, gonady oraz nerki. Każdy ww. narządów zostanie umieszczony na osobnej szalce Petriego i poddany dokładnym oględzinom makroskopowym. Z serca, wątroby, śledziony, trzustki, gonad oraz nerki zostaną wykonane nietrwałe preparaty mikroskopowe. Z wewnętrznej ściany pęcherza pławnego będzie wykonany wymaz, który zostanie poddany oględzinom mikroskopowym. Żołądek, po uprzednim przecięciu, zostanie opróżniony i jego zawartość oraz ściany wewnętrzne zostaną poddane oględzinom mikroskopowym. Jelito, w miarę stopnia wypełnienia pokarmem, będzie podzielone na krótsze odcinki. Z zawartości każdego z nich zostanie wykonany i poddany oględzinom nietrwały preparat mikroskopowy.

Ostatnim etapem badań parazytologicznych będzie poszukiwane pasożytów mięśniowych. W tym celu wypreparowana zostanie próbka mięśni (bez skóry) z grzbietowej części ryby (masa ok. 0,5 g). Następnie zostanie ona umieszczona w naczyniu z roztworem pepsyny (2000 FIP) oraz kwasu solnego (25%) i poddana obróbce cieplnej w cieplarce w celu jej wstępnego strawienia. Po wyjęciu z cieplarki nadtrawiona tkanka zostanie umieszczona w trichinoskopie i nastąpi przeglądanie preparatu pod kątem postaci larwalnych przywr digenicznych.

Po wypreparowaniu i zidentyfikowaniu stwierdzonych pasożytów zostaną wykonane trwałe preparaty mikroskopowe. W tym celu wybrane pasożyty będą przeprowadzone przez szereg alkoholowy, t.j. po uprzednim zabarwieniu barwnikiem, odpowiednim do danego gatunku pasożyta, poszczególne osobniki będą umieszczane w naczyniach z alkoholem o wzrastającym stężeniu (50%, 70%, 96%, 100%). Na koniec preparat zostanie prześwietlony w ksylenie lub olejku goździkowym, a następnie zatopiony w balsamie kanadyjskim. Pozostałe pasożyty będą przetrzymywane w 70% roztworze alkoholu etylowego.

W trakcie wszystkich omówionych wyżej etapów badań będzie wykonywana dokumentacja fotograficzna.

Końcowym etapem prac badawczych będzie parazytologiczny i statystyczny opis wyników wraz z oszacowaniem ryzyka zarażenia pasożytami. Określone zostaną wskaźniki parazytologiczne, takie jak prewalencja, intensywność zarażenia, zakres intensywności zarażenia oraz względna liczebność pasożytów. Określone zostanie obserwowane bogactwo gatunkowe pasożytów poszczególnych gatunków ryb z wybranych cieków. Za pomocą estymatorów bogactwa gatunkowego zostaną wykreślone krzywe akumulacji gatunków pasożytów. Przy użyciu oprogramowania Statistica zostaną wyznaczone korelacje pomiędzy wybranymi parametrami fizyko-chemicznymi wody oraz kondycją ryb a liczbą stwierdzonych pasożytów.